自由基清除剂 一、自由基清除剂简介自由基是人体正常的代谢产物，正常情况下人体内自由基是处于不断产生与清除的动态平衡中，人体内存在少量的氧自由基，不但对人体不构成威胁，而且可以促进细胞增殖，刺激白细胞和吞噬细胞杀灭细菌，消除炎症，分解毒物。但如果人体内自由基的数量过多，就会对生物膜和其他组织造成损伤，破坏细胞结构，干扰人体的正常代谢活动，引起疾病，加速人体衰老进程。在长期的进化过程中，生命有机体内必然会产生一些物质能清除这些自由基，将它们统称为自由基清除剂（Scavenger）。自由基清除剂是指能清除自由基或能阻断自由基参与的氧化反应的物质。自由基清除剂的种类繁多，可分为酶类清除剂和非酶类清除剂两大类。酶类清除剂一般为抗氧化酶， 主要有超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等几种。非酶类自由基清除剂一般包括黄酮类、多糖类、维生素C 、维生素E、β-胡萝卜素和还原型谷胱甘肽（GSH）等活性肽类。自由基清除剂大多为抗氧化剂，通过清除作用降低活泼自由基中间体浓度，降低自由基连锁反应中扩展阶段的效率来控制自由基的生成。但有些抗氧化剂是通过抑制自由基引发剂（如某些金属元素）的产生而起作用的。自由基清除剂也不都是抗氧化剂，有些系统并未进行氧化作用。自由基清除剂发挥作用必须满足三个条件：第一，自由基清除剂要有一定的浓度；第二，因为自由基活泼性极强，一旦产生马上就会与附近的生命大分子起作用，所以自由基清除剂必须在自由基附近，并且能以极快的速度抢先与自由基结合，否则就起不到应有的效果；第三，在大多数情况下，清除剂与自由基反应后会变成新的自由基，这个新的自由基的毒性应小于原来自由基的毒性才有防御作用。这些自由基清除剂对维持机体的正常生命活动，保持健康起着重要的作用。但是，随着年龄的增长，机体内产生自由基清除剂的能力逐渐下降，从而减弱了对自由基损害的防御能力，使机体组织器官容易受损，加速了机体的衰老，引发一系列的疾病。为了防止此类现象的发生，可以人为地由膳食补充自由基清除剂，从而达到防御疾病、延缓衰老的目的。二、酶类自由基清除剂（一）超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）超氧化物歧化酶（SOD）是目前研究得最深入、应用得最广泛的一种酶类自由基清除剂。 1．种类、结构及分布 1968年，美国人McCord在 Fridovich指导下，从牛红细胞中提取Cu•Zn的酶蛋白质，并发现它能催化O2－•歧化，所以把这种酶蛋白命名为超氧化物歧化酶，英文简称为SOD。 SOD存在于几乎所有靠氧呼吸的生物体内，包括细菌、真菌、高等植物、高等动物和人体中。SOD是一类含金属的酶，按其所含金属辅基不同可分为含铜锌SOD（Cu•Zn-SOD）、含锰SOD（Mn-SOD）和含铁SOD（Fe-SOD）3种。含铜锌金属辅基的Cu•Zn-SOD是最为常见的一种酶，主要存在于真核细胞的细胞质中或高等植物的叶绿体基质、类囊体内以及线粒体膜间隙中。在动物血液、牛肝、猪肝、牛心、豌豆、麦叶等动植物组织中均有存在，是目前应用最广泛的一类酶。该酶由两条肽链组成，每条肽链含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。 Fe-SOD主要存在于原核细胞中，一些真核藻类甚至高等植物如银杏、柠檬、番茄等组织内也有存在。此酶也由两条肽链组成，一般每个二聚体含有一个铁原子。 Mn-SOD主要存在于原核细胞和真核细胞的线粒体中，在植物的叶绿体基质、类囊体内也会存在，在人体肝脏中含量较高。此酶的纯品呈粉红色，由两条或四条肽链组成。 2．理化及生物学特性 SOD属酸性蛋白酶，对pH、热和蛋白酶水解等反应比一般酶稳定。又由于SOD属于金属酶，其性质不仅取决于蛋白质，还取决于结合到活性部位的金属离子。三类SOD的活性中心都含有金属离子。如采用物理或化学方法除去金属离子，则酶活丧失；如重新加上金属离子，则酶活又恢复。不同来源的Cu•Zn-SOD具有较高的同源性，它们的物化特性也很相似，据推测它们可能由同一原始酶进化而来。不同来源的Mn-SOD和Fe-SOD也具有相似的物理性质和较高的同源性，它们可能由另一原始酶进化而成。 SOD是生物体内防御氧化损伤的一种十分重要的金属酶，对氧自由基有强烈清除作用，特别对于超氧阴离子（O2－•）， SOD可将其催化歧化而生成H2O2和O2，故SOD又称为清除超氧阴离子自由基的特异酶。 3．SOD的生理功能及应用 SOD作为功能性食品基料的生理功能主要有以下几方面。（1）清除体内产生的过量的超氧阴离子自由基，保护DNA、蛋白质和细胞膜免遭O2－•的破坏作用， 减轻或延缓甚至治愈某些疾病，延缓因自由基损害生命大分子而引起的衰老现象，如延缓皮肤衰老和老年斑的形成等；（2）提高人体对自由基外界诱发因子的抵抗力，增强机体对烟雾、辐射、有毒化学品及医药品的适应性；（3）增强人体自身的免疫力，提高人体对自由基受损引发的一系列疾病的抵抗力，如炎症、肿瘤、白内障、肺气肿等，治疗由于免疫功能下降而引发的疾病；（4）清除放疗所诱发的大量自由基，从而减少放射对人体其他正常组织的损伤，减轻癌症等肿瘤患者放化疗时的痛苦及副作用；（5）消除疲劳，增强对剧烈运动的适应力。因此，具有清除自由基功能的SOD就成为医学、食品和生命科学等领域研究的热点。目前，SOD已广泛地应用于人们生活的各个方面。如深受女性消费者喜爱的化妆品中有大宝SOD、康妮SOD 、SOD 康舒达霜剂等。SOD添加于化妆品有明显的防晒效果和抗炎作用，可有效防止皮肤受电离辐射（如紫外线）的损伤。 SOD在医疗上的应用更是不胜枚举，它尤其对治疗关节炎和类风湿性关节炎疗效显著。此外，SOD对治疗癌症、缺血后重灌流损伤、肺气肿、白内障、糖尿病、贫血等疾病均有疗效。 SOD在食品方面的应用也极为广泛，可作为功能性食品的功能因子或食品营养强化剂，有良好的抗衰老、抗炎、抗辐射、抗疲劳等保健强身的效果。国外把SOD作为食品添加剂应用到口香糖和饮料中。国内也开发出了多种强化SOD的食品，如SOD雪糕、SOD豆奶、SOD啤酒、SOD果汁饮料、SOD的酸奶和SOD口服液等。还可用富含SOD的原料加工制成功能性食品，如大蒜饮料、刺梨SOD汁等。在人们越来越注重健康饮食的今天，SOD将成为功能食品中的活跃分子。然而，SOD作为一类高分子抗氧化酶，分子量在32000道尔顿以上，又都带有金属辅基，且其来源大多从动物血（猪血、牛血）和动物脏器以及某些微生物中制备而来，多为生物种属差异很大的异源性蛋白。因此，在应用上，它除了具有严格的针对性和有效性外，必然也有很大的局限性。SOD应用的局限性归纳起来主要有8个方面：（1）半衰期短。SOD的体内半衰期为6～8分钟，体外半衰期（25℃时）为9～10天。因此，体内注射表现为多次数、少浓度，体外涂抹则表现为高剂量、低效应；（2）代谢速率快。SOD在体内代谢速率极快，注射6小时后，90%以上的大分子SOD经降解为小分子而随泌尿系统排泄；（3）酶分子量大，均在32000以上。其中，原核细胞Mn-SOD分子量为40000；真核细胞线粒体Mn-SOD都由9个相等亚基组成，其分子量为80000。因此，透皮或透膜吸收困难，体内或细胞内作用弱；（4）酶制剂不宜口服，口服易被胃酸变性、胃蛋白酶和胰蛋白酶水解破坏，且SOD分子原形不易透过肠粘膜，因而难以发挥全身性药效作用；（5）大分子异性蛋白，不宜大剂量、长时间使用，否则会不可避免地出现某些过敏性变态反应，呈现明显的不良反应性变化；（6）对靶细胞或靶部位的亲和力低，药用趋向性不明显。因此，对疾病的疗效缺乏特异性作用；（7）酶的稳定性不高，对理化因素较为敏感，过高温度、过大剂量辐射、过长时间超声波、过强酸碱度、过多化学物质及变性剂、还原剂等均易导致SOD分子结构改变，酶活性丧失，形成不可逆性变化；（8）药物作用单一性大、常规剂量单独使用疗效欠佳。 针对SOD应用过程中客观存在的局限性，国内外学者进行了大量卓有成效的研究工作，并已逐步探索或寻找出解决上述局限的一些有效方法和对策。 4． SOD的制备 SOD广泛存在于动、植物和微生物体内，但目前我国主要是从动物血液中提取。受到血源和得率的限制，影响了SOD的生产成本和推广应用。由于利用微生物（深红酵母）生产SOD具有易培养、易大规模工业化生产、不受季节与自然条件限制等优越性，因此，微生物SOD的生成具有更广阔的发展前景。其工艺流程如下： 菌体培养→破壁→菌体破片 → Rnase酶解、离心30分钟 → 清液→ 上DE32柱 → 0.2mol/L NaCl洗脱 → 洗脱液→ 加45%（NH4）2SO4、离心 → 上清液 → 上DE32柱 → 洗脱 → 洗脱液→ 浓缩→ 冷冻干燥→ SOD成品。破菌的方法可采用超声波处理法、酶裂解法、细胞自溶法、氯仿-乙醇法和甲苯法等。根据有关的研究表明，用甲苯法破壁对提取酵母SOD具有一定的优越性。另外，为了提高SOD纯度，在洗脱时可采用梯度洗脱法。 5．SOD的纯度检查 SOD产品一般为浅绿色冻干粉，其纯度的检查主要根据以下三个指标。（1）均一性通常用聚丙烯酰胺凝胶电泳检查其均一性。也可用琼脂糖凝胶电泳，其操作简单，试剂单一且色带的间隔比前者大，更易观察与分析。还可进行超离心分析来检查其均一性。（2）酶的比活要求达到一定的标准。如：化妆品用SOD比活≥3000u/mg蛋白质；口服用SOD比活≥3500u/mg蛋白质；标准（活性测定用）及药用SOD比活≥5000u/mg蛋白质；试剂用SOD（电泳纯）比活≥8000u/mg蛋白质。（3）酶的重要理化性质最重要的是金属离子含量（常采用原子吸收分光光度法测定）、氨基酸含量和吸收光谱。如Cu•Zn –SOD中1分子的酶必须含有相当于两原子Cu和两原子Zn；虽然不同来源的酶所含的氨基酸不完全一致，但仍然显示一定的规律；三种SOD都有特定的吸收光谱，观察纯酶的吸收光谱有助于判断SOD的纯度。 6．SOD的（活性测定）分析方法一般分为直接法和间接法两大类。直接法往往需要操作复杂、价格昂贵的仪器，在一般试验室无法使用。间接法需借助超氧自由基产生剂和超氧自由基清除指示剂两种物质。其中常用的产生剂包括最早使用的黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶、邻苯三酚及近年发展起来的非酶体系的NADH-PMS、核黄素-TEMED、碱性二甲基亚砜、HXT-01050；清除指示剂则有最早发现的细胞色素C、NBT，到近年来的鲁米诺和MTT等。间接法中比色法最为常用，如黄嘌呤氧化酶-细胞色素C法和邻苯三酚自氧化法。这两种最为普及的方法多年来不断得到改进，其灵敏度也不断得到提高。另外，近年来新建立了多种方法，如化学发光法、光化学法、极谱氧电极法、免疫法等。其中化学发光法与极谱氧电极法由于方法简便、灵敏度高，受到人们的青睐。（1）黄嘌呤氧化酶（XO）- 细胞色素C法国外多以该法测定SOD活性。在SOD被发现之初就是利用此法进行测定的，又称之为McCord法，被认为是间接法中的经典方法。酶活性单位定义为：在一定条件下，3ml反应液中，每分钟抑制氧化型细胞色素C还原率达50%的酶量定为一个活力单位。 McCord法灵敏度较低，但采取以下措施可得到提高: ①用乙酰化细胞色素C替代细胞色素C，可将灵敏度提高一倍，而且使测定结果不受样品中细胞色素C氧化酶的影响； ②将pH7.8，0.05mo1/L磷酸缓冲液换成pH10.2的碳酸缓冲液，并将黄嘌呤浓度从0.05 mmo1/L 增至0.10 mmo1/L ，灵敏度可提高10倍； ③预先将黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶溶液在25℃下保温10分钟，使O2－•产量达到稳定程度，即O2－•产生率与其自动歧化率达到平衡，灵敏度增加可高达710倍； ④利用FP9平行分析仪可进行半自动分析，快速、简便，可以同时测定多个样品。（2）邻苯三酚自氧化法国外多使用经典的邻苯三酚自氧化法（简称Marklund法），Marklund法是采用420nm处光吸收测定。酶活力定义为：在一定条件下1ml的反应液中，每分钟控制邻苯三酚在420nm波长的自氧化速率达50%的酶量定为一个活力单位。该方法经过不断改进，操作更为简便、灵敏度更高。如将吸收波长由420nm改用325nm，测试灵敏度提高了6.4倍，称为微量邻苯三酚自氧化法，同时将邻苯三酚耗量减少一半； Marklund法的另一缺陷是呈色反应与光吸收值的测定必须同步进行，因此样品池必须保持恒温，且不能同时处理多个样品。通过使用二硫苏糖醇（DTT）或L-抗坏血酸（VC ）作为终止剂，使反应暂时停止，使A420在一定时间内保持恒定，可同时测多个样品，有较高的重复性和回收率。同时，终止剂既不参与，也不影响邻苯三酚的呈色反应，自氧化曲线与经典法的相吻合，最大抑制百分比和灵敏度也基本一致。另外，为消除HCl对SOD的抑制作用，改用K2HPO4- KH2PO4缓冲液替代Tris - HCl缓冲液，灵敏度可提高50%。（3）化学发光法化学发光法依据的原理是：O2－•可与化学发光剂鲁米诺（luminol）反应，产生激发态产物，当其迅速返回基态时，即发出光。SOD可消除O2－•，从而使发光强度降低，SOD浓度与发光百分率在一定时间内呈线性关系。活力单位定义为：在一定条件下，使每毫升反应液于1分钟末发光率被抑制50%的酶量作为一个酶活力。同传统的比色法相比较，化学发光法专一性较强，其他干扰因素少，灵敏度高，最适用作粗提取液中SOD活性的检测。（4）极谱氧电极法比色法测定的呈色反应往往不稳定，因此测定结果波动很大。极谱氧电极法利用了系统产生O2－•过程中消耗O2，一定量的SOD又会使O2－•歧化产生O2，从而使耗氧量减少的特性，使用极谱氧电极仪精确测出耗氧量而推算出酶活。SOD活力单位定义为：25℃， pH8.4，使每分钟产生1μl O2的SOD量定为1个酶活力单位。该方法利用了O2张力的变化，与所用试样的物理状态如澄清度、是否胶体或悬浊液、有无颜色等无关，尤其适用于各种组织匀浆。而且由于直接测定O2量，方便、快速、微量化、灵敏度高、重复性好，且可自动连续记录酶作用过程的变化。 除了以上几种方法，其他方法如光化学法（正染法）等方法也都得到不断的改进；而灵敏度、特异性均高于一般化学法的免疫法在医学上也得到应用，并取得了很好效果。同时计算机也开始用于SOD的活性分析，并有用于SOD酶活力线性分析的专用软件，可适用于各种产O2－•系统、各种清除剂系统及不同的酶提取液的活力测定。（二）过氧化氢酶（catalase，CAT）过氧化氢酶是另一种酶类清除剂，又称为触酶，是以铁卟啉为辅基的结合酶。它可促使H2O2分解为分子氧和水，清除体内的过氧化氢，从而使细胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。CAT作用于过氧化氢的机理实质上是H2O2的歧化，必须有两个H2O2先后与CAT相遇且碰撞在活性中心上，才能发生反应。H2O2浓度越高，分解速度越快。几乎所有的生物机体都存在过氧化氢酶。其普遍存在于能呼吸的生物体内，主要存在于植物的叶绿体、线粒体、内质网、动物的肝和红细胞中，其酶促活性为机体提供了抗氧化防御机理。 CAT是红血素酶，不同的来源有不同的结构。在不同的组织中其活性水平高低不同。过氧化氢在肝脏中分解速度比在脑或心脏等器官快，就是因为肝中的CAT含量水平高。自1937年首次推出作为细胞内结晶化酶之一的牛肝过氧化氢酶之后，已利用不同方法（选择性沉淀法和层析法）从牛、马或人的红细胞、肝和肾中提纯过氧化氢酶。从不同机体分离出的大多数过氧化氢酶的分子量为240kDa，并具有4个相同的亚单位，在其活性部位各含一血红素基团。来自哺乳动物以及某些真菌和细菌的过氧化氢酶还含有4个紧密结舍的NADPH分子，但其功能尚有争议。常用的CAT酶活性测定方法有以下几类：（1）分光光度法 包括钼酸铵比色法、紫外速率直接法和改良比色法等。其中改良比色法简便，快速，显色稳定，重复性好，不需特殊试剂及仪器设备，适合一般实验室采用，但生物样品常会造成干扰；（2）化学发光法 鲁米诺（luminol）在一定条件下与H2O2及Co2+等金属离子共存时发出强烈的蓝光，当样品中有CAT存在时，基质的H2O2将被分解，由H2O2所引起的化学发光强度减弱，由此计算总CAT酶活性。化学发光法易受试剂配制、操作技术和条件及测定时间等多种因素影响，但经过方法改进，可排除各种不良因素对测定的影响，是一种简单灵敏、重复性好、特异性也较高的化学发光技术测定方法；（3）极谱法 溶液中两个电极间加以一定的电压（极化电压）后产生可测电流，极谱法是应用氧电极，通过测量这种电解电流量以测定溶质的方法。当反应体系中含有一定浓度的过氧化氢时，加入一定量的含有过氧化氢酶的样品，过氧化氢就被分解而产生氧气，记录仪上可显示出反应室中氧量增加，增加的程度与加入液体中酶的活性成正比。该方法广泛用于生化方面的研究工作；（4）滴定法 包括:①过硼酸盐底物法：在中性水溶液中，CAT催化过硼酸盐还原成硼酸盐，同时释出氧。经过一定时间后，加入硫酸使酶失活，以中止反应，用高锰酸钾溶液滴定残存的过硼酸盐，结果反映CAT活性；②过氧化氢滴定法；一定量的细菌同一定量的H2O2发生反应，经过一定时间后加酸中止反应，然后用高锰酸钾滴定剩余的H2O2量，从而测定细菌过氧化氢酶的活性。（5）检压测定法 在一定pH的缓冲液中，过氧化氢酶作用于过氧化氢释出氧气。此反应非常迅速、剧烈，在不断搅拌、震荡及减压的条件下，所产生的氧气得以迅速逸出溶液，在一定容量的容器内产生压力变化，压力变化数值可换算成产氧量，用来表示样品过氧化氢酶的活性。（三）谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）是在哺乳动物体内发现的第一个含硒酶，它于1957年被Mills首先发现，但直到1973年才由Flohe和Rotruck两个研究小组确立了GPX与硒之间的联系。研究表明，硒是谷胱甘肽过氧化酶（Se-GPX）的活性成分，是GPX催化反应的必要组分，它以硒代半胱氨酸（Sec）的形式发挥作用，摄入硒不足时使Se-GPX酶活力下降。在体内处于低硒水平时，活力与硒的摄入量呈正相关，但到一定水平时，酶活力不再随硒水平上升而上升。Se-GPX存在于胞浆和线粒体基质中，它以谷胱甘肽（GSH）为还原剂分解体内的氢过氧化物，能使有毒的过氧化物还原成无毒的羟基化合物，并使过氧化氢分解成醇和水，因而可防止细胞膜和其它生物组织免受过氧化损伤。它同体内的超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）一起构成了抗氧化防御体系，因而在机体抗氧化中发挥着重要作用。机体在正常条件下，大部分活性氧被机体防御系统所清除，但当机体产生某些病变时，超量的活性氧就会对细胞膜产生破坏。机体消除活性氧O2－•的第一道防线是超氧化物歧化酶（SOD），它将O2－•转化为过氧化氢和水，而第二道防线是过氧化氢酶（CAT）和GPX。CAT可清除H2O2，而GPX分布在细胞的胞液和线粒体中，消除H2O2和氢过氧化物。因此，GPX、SOD和CAT协同作用，共同消除机体活性氧，减轻和阻止脂质过氧化作用。 GPX广泛存在于哺乳动物的组织中，不同种类的GPX其分子量和比活性也有所不同。谷胱甘肽是此酶的特异性专一底物，而氢过氧化物则是非专一性底物。 GPX的活力测定常采用5，5′-二硫代对二硝基苯甲酸（DTNB）法，用单位时间内催化GSH氧化的减少量表示。GSH可和二硫代对二硝基苯甲酸（DTNB）反应生成黄色的5-硫-2,2-硝基苯甲酸阴离子，在412nm处有最大光吸收，测定该离子的浓度，即可计算出GSH减少的量。由于上述反应在非酶条件下仍能进行，故计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少量。