各种方法可以从鱼油中浓缩EPA和DHA，但不能将EPA与DHA相互分离开。在使用各种方法相互分离EPA与DHA时，必须首先从鱼油复杂的脂肪酸成分中分离出多不饱和脂肪酸浓缩物，再加以单独分离。
（1）减压蒸馏法与分子蒸馏法
脂肪酸的碳链越长沸点越高，不同碳链数的脂肪酸可使用蒸馏方法分离出来。如油酸（C18: 1）与硬脂酸（C18: 0）由于碳数相同，蒸气压相差不大，故很难通过蒸馏分离开。所以在预处理时，一定要把饱和及低度不饱和脂肪酸尽可能地去除。
在减压蒸馏时，为了降低其沸点，通常先甲酯化来进行蒸馏。EPA在665Pa压力下沸点在200℃以上，而DHA的沸点则更高。在如此高温下操作，可能会发生聚合及环肽化等化学反应。为了降低其沸点，在进行减压蒸馏时将尽可能地提高真空度，此时压力稍微变化对馏出物会有极大的影响，故必须维持一定的压力。另外，精馏设备的性能对分离效果影响也很大，精馏装置一定要极精密才行。如果一次减压蒸馏馏出物纯度不够时，可重复操作以提高纯度。
大量分离EPA时，必须使用高浓度减压蒸馏法，在特殊情况下也可使用分子蒸馏法。普通的蒸馏是以物质蒸气压大于外界气压而发生激烈的沸腾现象。而分子蒸馏，由于高度的真空使分子有极自由的挥发性，理论上的沸点已存在，但是仍可从温度和浓度关系中求出目的物蒸出量的极大值。
由鳕鱼肝油脂肪酸用锂盐丙酮法得到的多不饱和脂肪酸甲酯化，然后在0.013Pa压力下进行分子蒸馏，可有效地得到接近纯粹的EPA及DHA。
（2）高效液相色谱法（HPLC）
以浓缩鱼油（EPA，30% ，DHA，30%）为原料，先进行甲酯化，然后取10g注入大型管柱中，结果如表1-7所示。
表1-7 HPLC法分离EPA与DHA的甲酯回收率
| 脂肪酸甲酯 | 重量/% 纯度/% 回收率/% |
| EPA甲酯 | 2.0 91.0 66.7 |
| DHA甲酯 | 1.6 85.5 53.3 |
（3）超临界CO2萃取法
浓缩鱼油先甲酯化后，根据此法在一定压力及温度下分离2次，脂肪酸得率79.85%，纯度91.9%；EPA的得率为77％，纯度48.2％。